MarioとLuigiが再びMushroom Kingdomを救うために戻ってきた。今回の敵はBowserの7人の子供たちであるKoopalingsだ。それぞれが特定のワールドを支配し、魔法の杖で王様を動物に変えてしまっている。ゲームはオーバーワールドマップから始まり、様々なステージをつなぐルート、キノコハウス(ボーナスアイテム入手場所)、ハンマーブロスとの遭遇、少なくとも1つのお城、そして攻略必須の飛行船が存在する。プレイヤーはオーバーワールドマップ上でキャラクターを移動させ、各地点に入ることでその面をプレイすることができる。ステージのスタイルは多彩で、比較的シンプルに進めるものもあれば、土管を通じてアクセスする別エリアを持つものもあり、正しいルートを考えながら進む必要があるものもある。ゲームプレイの基本は、プラットフォームを歩き、走り、ジャンプしながらGoombaやKoopa(ノコノコ)などの敵を避けたり倒したりすることで、ほとんどの敵は上から踏みつけることで倒せる。
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